顺铂联合雷帕霉素或3-甲基腺嘌呤对肺腺癌A549细胞抑制作用的研究

目的观察非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)中肺腺癌A549细胞在顺铂(cisplatin,CP)联合雷帕霉素(rapamycin,RAPA)或3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)作用下的结果,为提高顺铂的化疗效果提供理论依据。方法 2013年3月至2014年6月期间,通过对人肺腺癌细胞株A549(由河北医科大学第四医院科研中心提供)经四甲基偶氮唑盐3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT)实验检测顺铂、雷帕霉素和3-MA对A549细胞的增殖抑制率,计算出各药物的50%细胞抑制浓度(50%inhibitory concentration,IC50),并以此作为实验浓度。实验分为4组:对照组(无药物干预)、顺铂组(加15μmol/L的顺铂)、顺铂+雷帕霉素组(加10nmol/L的雷帕霉素1h后再加15μmol/L的顺铂)、顺铂+3-MA组(加3μmol/L的3-MA 1h后再加15μmol/L的顺铂),将对数生长期的肺癌A549细胞以每孔1.0×10^6/ml密度接种于6孔培养板中,待细胞长至孔底面积约70%~80%后分别加入稀释好的药物,分别培养24、48、72h。肺癌A549细胞的生长迁移情况用细胞划痕实验检测,mTOR、LC3-Ⅱ及Bax mRNA和蛋白的表达情况用RT-PCR(逆转录-聚合酶链反应)、Western blot(蛋白质印迹)法检测。数据处理采用SPSS 17.0统计软件进行分析。结果顺铂IC50:15μmol/L;雷帕霉素IC50:10nmol/L;3-MA IC50:3μmol/L。划痕实验显示24h顺铂+雷帕霉素组细胞迁移能力最弱,48h和72h顺铂+3-MA组细胞迁移能力最弱。RT-PCR显示顺铂+雷帕霉素组LC3-ⅡmRNA的2-△△Ct值(24h:1.686±0.069;48h:1.803±0.083;72h:1.836±0.056)与顺铂组(24h:1.489±0.031;48h:1.325±0.007;72h:1.428±0.080)相比表达量均明显上升(24hF=149.780,P<0.01;48hF=111.599,P<0.01;72hF=167.855,P<0.01);而顺铂+3-MA组的Bax mRNA的2-△△Ct值(48h:1.864±0.104;72h:1.935±0.068),与顺铂组(48h:1.346±0.080,72h:1.462±0.029)相比,表达量均明显上升(48hF=52.853,72hF=202.118;P值均<0.01)。Western blot显示顺铂+雷帕霉素组LC3-Ⅱ蛋白(48h:0.556±0.010;72h:0.571±0.009)与顺铂组(48h:0.426±0.0107;72h:0.492±0.009)相比表达量均显著上升(48hF=372.056,72hF=930.500;P值均<0.01);而顺铂+3-MA组的Bax蛋白(48h:0.897±0.022;72h:0.916±0.005),与顺铂组(48h:0.463±0.011;72h:0.581±0.007)相比,表达量均显著上升(48hF=1100.412,72hF=5715.778;P值均<0.01)。结论顺铂联合雷帕霉素或3-MA较单独使用顺铂能更好的抑制A549细胞的生长,长时间用药时顺铂联合3-MA作用最强。     

HPLC法测定含体外培育牛黄复方制剂中马来酸氯苯那敏的含量

目的：现有测定小儿氨酚黄那敏颗粒中马来酸氯苯那敏（CM）含量的HPLC方法均是针对含有人工牛黄的制剂,由于人工牛黄和体外培育牛黄成分差异巨大,体外培育牛黄干扰这些HPLC法测定CM,所以本研究建立了含体外培育牛黄的小儿氨酚黄那敏颗粒中马来酸氯苯那敏含量测定的新HPLC方法,该法同时也适用于含人工牛黄的小儿氨酚黄那敏颗粒中CM含量测定。方法：采用Intersil ODS-3 C18色谱柱,以磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢铵5.75 g,磷酸0.5 mL,加水1000 mL）- 乙腈（78 : 22）为流动相,检测波长为262 nm,流速为 1.0 mL? min-1,柱温为30℃,进样量为20 μL。结果：马来酸氯苯那敏在5 μg? mL-1 ～ 30 μg? mL-1范围内峰面积与测定浓度呈良好的线性关系,回归曲线为：y = 14.45349x - 1.7506,r = 0.9995,准确度为100.7 %,精密度RSD为0.7 %。室温下,马来酸氯苯那敏溶液在24 h内稳定。结论：该方法快速简便,专属性强、重现性好,适用于含体外培育牛黄和人工牛黄的小儿氨酚黄那敏颗粒中马来酸氯苯那敏的含量测定。     

SHH基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的 探讨SHH基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)的可行性.方法 利用电转法将SHH基因转染人大鼠骨髓间充质干细胞,在荧光显微镜下观察转染效率;分别绘制未转染及转染SHH基因后细胞生长曲线,观察转染对细胞的影响;采用PCR、RT-PCR、Western-blot检测转染后骨髓间充质干细胞中外源性SHH基因的表达情况.结果 生长曲线显示转染后骨髓间充质干细胞生长曲线指数生长期及平台期延后,在转染后第12天与未转染达到一致.转染后48 h(即将用于移植前),经荧光倒置显微镜观察转染效率为30％,PCR检测转染后骨髓间充质干细胞中SHH表达较未转染细胞明显升高,实时定量PCR检测其升高约7倍左右,通过Western-blot检测转染后SHH蛋白产物表达明显升高.结论 电转法能够有效将外源性SHH基因转染人大鼠MSC并能获得有效表达,为进一步大鼠缺血性心脏病模型的在体基因治疗提供了前提基础.     

MiRNA-132上调脑源性神经营养因子表达抑制β-淀粉样蛋白诱导的神经元损伤研究

研究背景脑源性神经营养因子(BDNF)在阿尔茨海默病(AD)发病机制中发挥重要作用,微小RNA-132(mi RNA-132)在神经元呈高表达,可以通过调控靶基因表达参与BDNF介导的神经发育过程。本研究旨在探讨阿尔茨海默病神经元模型中mi RNA-132与BDNF的调控关系和神经保护作用。方法体外培养海马神经元72 h后慢病毒转染mi RNA-132,并于体外培养第7天以β-淀粉样蛋白(Aβ)处理制备阿尔茨海默病神经元模型;实时荧光定量聚合酶链反应观察对照组与AD组mi RNA-132表达差异以及不同处理组BDNF m RNA表达变化,噻唑蓝法观察不同处理方式对细胞活性的影响。结果 (1)AD组海马神经元mi RNA-132(t=13.888,P=0.000)和BDNF m RNA(t=-12.274,P=0.000)表达水平均低于对照组。(2)原代培养的海马神经元经慢病毒转染后倒置相差荧光显微镜可见绿色荧光蛋白,对照组(t=16.135,P=0.000)和AD组(t=8.656,P=0.000)转染过表达mi RNA-132后均能上调BDNFm RNA表达。(3)AD组海马神经元活性降低(t=-6.023,P=0.000),AD组转染mi RNA-132后神经元活性增强(t=3.385,P=0.007),予以外源性BDNF共培养后神经元活性明显改善(t=3.672,P=0.004)。结论阿尔茨海默病神经元模型mi RNA-132和BDNF表达水平均下降,mi RNA-132可上调BDNF表达,提示mi RNA-132和BDNF对阿尔茨海默病神经元模型具有神经保护作用,有望为阿尔茨海默病诊断与治疗提供新的视角。     

人胎肝干细胞的体外培养及诱导分化

为体外分离培养和诱导分化人胎肝干细胞 ,从原代分离培养人胎肝干细胞集落 ,免疫细胞化学鉴定细胞集落分子标志物的表达 ;在体外特定细胞因子作用下诱导干细胞定向分化为成熟肝脏细胞 ,对其生物学特性进行初步鉴定。结果 ,从人胎肝组织中成功分离表达AFP、Albumin、Cytokeratin等标志物的胎肝干细胞集落 ,在体外特定细胞因子作用下肝干细胞可定向分化为成熟肝脏细胞。因此人胎肝中同样存在具有干细胞特性的原始细胞 ,体外可定向分化为成熟肝细胞。人胎肝干细胞的分离培养对于生物型人工肝的制备及其深入研究奠定了良好的基础     

氨基胍延缓人胚肺二倍体成纤维细胞复制性衰老的实验研究

目的探讨人工合成单体抗氧化剂氨基胍（2-AG）对人胚肺二倍体成纤维细胞（2BS）复制性衰老的影响及其分子机制。方法观察2-AG对2BS细胞衰老表型、细胞代龄、传代速度、细胞周期、细胞增殖能力、晚期糖基化终末产物（AGEs）水平及衰老相关β半乳糖苷酶（SA-β-Gal）阳性率的影响。结果2-AG可维持细胞的非衰老表型，增加2BS细胞代龄19～20代，MTT法分析发现用2-AG孵育细胞84h，细胞增殖能力较对照组升高36％～40％。2-AG显著加快了细胞的增殖速度，其培养细胞S期的比例较对照细胞升高约1倍。另外，2-AG连续培养的细胞在老龄阶段AGEs、SA-β-Gal阳性率均显著低于老年对照细胞，而与年轻2BS细胞相似。结论2-AG可有效延缓2BS细胞的复制性衰老。     

骨髓间充质干细胞心肌样分化的微环境因素

目的:探讨促使骨髓间充质干细胞(MSCs)心肌样分化的微环境因素。方法:分离大鼠MSCs并传至第6代,随机分为混合培养组、条件组及对照组,分别将MSCs与大鼠心肌细胞共同培养(混合培养组),或将心肌细胞培养上清液加入MSCs培养体系(条件组)。1周后,检测MSCs的心肌特异性蛋白titin、Cx43及MHC表达情况。结果:MSCs能在心肌细胞培养上清液及与心肌细胞共同培养中正常生长;条件组MSCs表达titin、Cx43显著增加,但未观察到肌小节样结构;混合培养组MSCs可表达上述蛋白,且部分细胞中可观察到肌小节样结构,与心肌细胞交界面上有Cx43的聚集。3组MSCs均未检测到MHC表达。结论:心肌细胞自身、源于心肌的体液因素及MSCs分化过程中形成的感应器是MSCs心肌样分化的必要条件。